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详细内容

细胞冻存实验技术

一、基本原理及实验目的

细胞冻存是通过向培养液中加入保护剂,减少冻存过程中细胞内冰晶形成,来保护细胞,是保存细胞的基本方法。

二、主要仪器及试剂

10.25%胰蛋白酶:称取胰蛋白酶粉末0.25g,加入100ml PBS,充分溶解后过滤除菌备用,4℃保存。

2、20%胎牛血清的培养液:将培养液和胎牛血清按4:1比例混合,过滤除菌备用,4℃保存。

3、细胞冻存液:含20%胎牛血清的培养液和DMSO按照9:1比例混合,备用。

4、弯头滴管、移液器及枪头、冻存管等。

三、操作步骤(以贴壁生长的细胞为例)

1、取对数生长期的细胞,当细胞增殖至培养瓶底(25cm2培养瓶为例)80%时,用弯头滴管吸出培养基。

2、加入1ml胰蛋白酶,洗涤1次后弃去瓶中液体。

3、重新加入1ml胰酶,消化细胞。

4、倒置显微镜下观察,当细胞变圆并有部分细胞脱壁后,加入1ml含有血清的培养基终止消化。

5、用滴管吸取瓶中液体轻轻吹打培养瓶底,使细胞完全脱壁。

6、将细胞悬液移入离心管,800rpm离心5min

7、弃去离心管中液体,加入培养基2ml,用滴管轻轻吹打,使细胞重悬。

8、800rpm离心5min

9、用滴管吸去离心管中液体。

10、加入1ml细胞冻存液,重悬细胞。

11、将细胞悬液移入冻存管中,4℃放置30min

12、-20℃放置2h-70℃过夜。

13、放入液氮中保存。

四、结果判读

判断细胞冻存的好坏,需要看复苏后,细胞的贴壁率及细胞状态。若复苏后细胞95%以上贴壁,而且细胞状态良好,这就说明细胞冻存的过程没有问题。

五、注意事项

1、所有的细胞实验中均需要注意无菌操作。

2、细胞冻存的过程,降温的速率要小。过快地降温,会因细胞内形成冰晶而使细胞死亡。

3、冻存的细胞一定要做好名称和日期等标记。

六、实验心得

细胞冻存前,一定要观察细胞的状态,细胞状态的好坏直接决定了复苏后细胞的生长情况。在冻存的前一天需要给细胞换液,保证细胞冻存前有足够的营养,以保持很好的细胞增殖状态。对于增殖比较旺盛的细胞,在冻存时可以用相对较小的浓度,一般情况下,长满一个25cm2培养瓶的细胞冻存一支就够了。对于增殖比较缓慢的细胞,一般长满两个25cm2培养瓶的细胞冻存一支。

对于一些原代细胞来说(如某些正常细胞),冻存的效果可能不会太好。在实验的过程中我们发现,配制冻存液的时候,用含10%胎牛血清的培养液或者含20%胎牛血清的培养液或者纯血清,好像对细胞的影响并不是很大,但是如果DMSO的浓度高于10%,将会对细胞产生很大的毒性。如果细胞只是短期内不用(3个月以内),将细胞冻存-70℃冰箱中即可;若长期不用,建议还是将其保存在液氮中。对于悬浮生长的细胞,省去胰酶消化环节,直接收集细胞悬液,离心即可。另外,操作细胞前,建议将培养基和胰酶平衡到室温或37℃,以减小对细胞的影响。


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